Оптическая микроскопия - что есть что?
Перед тем как начать разговор о методах наблюдения нужно понять, что в микроскопе любого назначения учитываются такие важные параметры как разрешающая способность и полезное увеличение.
Одной из важнейших характеристик микроскопа является его разрешающая способность, т.е. минимальное расстояние между точками предмета, которые изображаются как раздельные. Разрешающая способность зависит от длины волны и числовой апертуры микроскопа. Повысить разрешающую способность микроскопа можно двумя способами: либо увеличивая апертуру объектива, заполнив пространство между рассматриваемым предметом и объективом иммерсионной жидкостью, либо уменьшая длину волны света, освещающего препарат. Для увеличения разрешающей способности также применяют ультрафиолетовые лучи, длина волны которых меньше, чем у видимых лучей.
Для того, чтобы глаз наблюдателя мог полностью использовать разрешающую способность микроскопа, необходимо иметь соответствующее видимое увеличение. Так что же такое полезное увеличение микроскопа? Полезное увеличение – это видимое увеличение, при котором глаз наблюдателя будет полностью использовать разрешающую способность микроскопа, т.е. разрешающая способность микроскопа будет такая же, как и разрешающая способность глаза. Если разрешающую способность микроскопа перевести в математическую величину (мегапиксели) используя дифракционную теорию Аббе, то она окажется равна 3 Mpxl. Таким образом, при использовании фотокамер большого разрешения, а тем более зеркальных фото камер, когда роль глаза выполняет объектив камеры, - «гонка» за мегапикселями становится бессмысленной, тем более при выводе изображения на экран телевизора. При использовании монитора компьютера полезным разрешением цифровой камеры будет 6 – 10 Mpxl, но тут уже имеют место характеристики видеокарты и монитора ПК.
Существуют пределы полезного увеличения микроскопа. Они лежат в пределах от 500 до 1000 апертур (в данном случае имеется в виду диаметр действующего отверстия, определяемый размерами линз или диафрагм). Таким образом, становится очевидно, что микроскоп с видимым увеличением меньше 500А не позволяет различить глазом все тонкости структуры предмета, которые изображаются как раздельные данным объективом; использование видимого увеличения больше 1000А нецелесообразно, т.к. разрешающая способность объектива не позволяет полностью использовать разрешающую способность глаза.
Теперь про освещение. Обычно предметы, исследуемые под микроскопом, сами не светятся и, следовательно, нуждаются в постороннем освещении. Во многих случаях рассматриваемые предметы представляют собой тонкий срез прозрачного вещества и наблюдаются в проходящем свете. Иногда вполне достаточно рассеянного дневного света, отраженного под углом от вогнутого зеркала. Но чаще всего необходимо пользоваться искусственными источниками и специальными осветительными системами.
В современной микроскопии зеркала уже практически не используются. Основными источниками света стали галогенные лампы, встроенные в систему освещения (штатив) микроскопа. Галогенные лампы – это удобный источник света при обычных исследованиях, их используют для освещения препаратов как проходящим, так и отраженным светом, их можно легко и часто включать и выключать, не опасаясь повредить лампу. Номинальными лампами, исходя из многолетнего опыта конструкторов осветительных систем, являются лампы мощностью 6В; 12Вт, 6В;15Вт, 6В;20Вт, 6В;25Вт, 6В;30Вт – для биологических микроскопов, 12В;10Вт, 12В;15Вт, 12В;20Вт – для стереоскопических микроскопов, 8В;20Вт – для металлографических, 9В;20Вт, 9В;70Вт 12В;50Вт, 12В;100Вт – для поляризационных и специальных измерительных (криминалистических) микроскопов. Для работы в свете люминесценции применяют ртутные 100Вт лампы. Почему именно 100Вт? Лампа мощностью 100Вт имеет меньшую дугу, чем лампы 50Вт и 200Вт, и пики ее длины волны лежат в диапазоне 300-700нм, а средняя плотность свечения достигает 170000Лк (у ламп мощность 50Вт и 200Вт средняя плотность 33000Лк и 30000Лк соответственно). Продолжительность эксплуатации достигает 200 часов.
Что касается использования диодов, то эти работы не дали результатов, т.к. светодиод имеет другой спектральный диапазон и при использовании дает цветовое искажение. Например, при использовании диода в биологическом медицинском микроскопе МИКМЕД-6 для клинического анализа крови лаборант не смог определить составляющие, т.к. существует специальная методика, где дословно прописано, что какого цвета должно быть и как выглядеть. Другими словами, структуру препарата, рассматриваемого через микроскоп, можно различить лишь тогда, когда частицы препарата отличаются друг от друга и от окружающей их среды по поглощению (отражению) света или по показателю преломления. Поэтому, в зависимости от характера препарата, в микроскопии применяются различные методы наблюдения.
На практике методы светлого и темного поля, фазовый контраст и поляризованный свет реализуются на современных микроскопах серии МИКМЕД-5 и МИКМЕД-6, а также на поляризационных микроскопах ПОЛАМ И ПЛМ и металлографических микроскопах МЕТАМ, ММН, ММР и НИМ.
Метод светлого поля
| В проходящем свете | В отраженном свете |
|---|---|
| Метод применяется при исследовании прозрачных препаратов, у которых различные участки структуры по разному поглощают свет (тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и другие). Пучок лучей из осветительной системы проходит препарат и объектив и дает равномерно освещенное поле в плоскости изображения. Поглощающие элементы структуры препарата частично поглощают и отклоняют падающий на них свет. | Применяется для наблюдения непрозрачных объектов (травленые шлифы металлов, биологических тканей и различных минералов). Освещение препарата производится, через объектив, который одновременно выполняет и роль осветительной системы. Изображение, как и при проходящем свете, создается за счет того, что разные участки препарата неодинаково отклоняют падающий на них свет, а отраженные лучи имеют различную интенсивность. |
Метод темного поля.
| В проходящем свете | В отраженном свете |
|---|---|
| Применяется в биологии, коллоидной химии, минералогии и других областях для получения изображения прозрачных, непоглощающих, а потому и не видимых при наблюдении в светлом поле объектов. Пучок лучей, освещающий препарат, непосредственно в объектив не попадает. Изображение создается только светом, который рассеивается мелкоструктурными элементами препарата. В поле зрения микроскопа на темном фоне видны световые изображения мелких деталей, тогда как у крупных деталей видны только световые края, которые рассеивают освещающие лучи. | Осуществляется путем освещения препарата, например шлифа металла или биологической ткани, с помощью специальной кольцевой зеркальной системы, расположенной вокруг объектива. Также как и при проходящем свете, изображение создается только лучами, рассеянными объектом, тогда как лучи света, отразившиеся от поверхности объекта, в объектив не попадают. |
Метод исследования в поляризованных лучах.
Применяется как в проходящем, так и в отраженном свете для так называемых анизотропных объектов, обладающих двойным лучепреломлением или отражением. Такими объектами являются многие минералы, угли, некоторые животные и растительные ткани и клетки, искусственные и естественные волокна.
При исследовании анизотропных препаратов к обычной схеме микроскопа перед осветительной системой добавляют поляризатор, а после объектива – анализатор, находящиеся в скрещенном, либо параллельном положении относительно друг друга. При скрещенном поляризаторе и анализаторе в темном поле зрения микроскопа видны темные, светлые или окрашенные анизотропные элементы объекта. Вид этих элементов зависит от положения объекта относительно плоскости поляризации и от величины двойного лучепреломления. Более точное определение оптических данных объекта делается с помощью различных компенсаторов (неподвижных кристаллических пластинок, подвижных клиньев и пластинок).
Метод фазового контраста.
Фазовый контраст дает возможность получать контрастные изображения прозрачных и бесцветных объектов. К числу таких объектов относятся, например, неокрашенные биологические препараты, нетравленые шлифы металлов и минералогические объекты. Темные и светлые места в фазово-контрастном изображении соответствуют различным показателям преломления в препарате.
Принцип действия метода основан на том, что незаметные для глаза изменения фазы пучка, прошедшего через объект, можно преобразовать в видимое изменение интенсивности. На пути лучей, не отклоненных из-за дифракции на объекте, располагается так называемая «фазовая пластинка», увеличивающая разность фаз до половины длины волны. Таким образом, лучи могут интерферировать, и прежде не видимый объект проявляется на темном или светлом фоне.
Другие методы наблюдения в оптической световой микроскопии
Световая микроскопия включает значительное число методов контрастирования, позволяющих получать информацию о структуре объектов с различными оптическими свойствами: прозрачных, слабоконтрастных, анизотропных, сильно рассеивающих или отражающих. Ниже приведены основные методы, применяемые в современной микроскопии. Для каждого метода указаны реальные приборы из модельного ряда ЛОМО / Микроанализ, на которых он корректно реализуется.
Дифференциально-интерференционный контраст (DIC, Nomarski)
Метод обеспечивает высокий псевдорельефный контраст прозрачных объектов за счёт интерференции двух когерентных пучков, разделённых по поляризации и сдвинутых по фазе. Необходимы DIC-объективы, DIC-конденсор и призмы Номарского.
Используется в исследованиях живых клеток, неокрашенных тонких структур, фазовых границ, микрорельефа. Реализуется на исследовательских биологических микроскопах семейства БЛМ и металлографических системах МИМ 43.
Интерференционная микроскопия
Позволяет измерять толщины плёнок, микрорельеф, дефекты поверхности с разрешением до десятков нанометров. Основана на анализе интерференционной картины между эталонным и объектовым пучками.
Применяется при исследовании оптических плёнок, кремниевых пластин, юстировке микросистем. Осуществляется на микроинтерферометре МИИ-4М (Микроинтерферометр ЛОМО).
Флуоресцентная микроскопия
Метод основан на возбуждении флуорофоров УФ/синим светом и регистрации люминесценции. Используется в иммунологии, цитологии, генетике, микробиологии, криминалистике.
Полный спектр флуоресцентных каналов реализован в микроскопе БЛМ-Л, а также в инвертированных микроскопах НИБ-ФЛ
Метод косого освещения
Объект освещается под наклонённым углом, что подчёркивает рельеф, края, зернистость поверхности. Применяется в металлографии, дефектоскопии, гистологии, микротехнике.
Реализуется на металлографических микроскопах МЕТАМ РВ/ЛВ.
Контраст по Рейнбергу (Rheinberg Illumination)
Модификация темного поля, основанная на использовании цветных центрального и кольцевого фильтров. Позволяет подсвечивать различные элементы структуры разными цветами.
Модуляционный контраст Хоффмана (HMC)
Метод повышает контраст прозрачных объектов за счёт модуляции амплитуды и фазовых изменений в объекте. Близок по задачам к фазовому и дифференциально-интерференционному контрасту.
Применяется в эмбриологии, работе с клеточными культурами, наблюдении живых объектов in vitro. Поддерживается на МИБ-2 (исследовательские комплектации).
Метод скользящего освещения
Промежуточный метод между косым освещением и темным полем. Даёт выраженный рельефный контраст.
Фазово-дифференциальный контраст
Комбинированный метод, объединяющий элементы фазового и дифференциального контраста, что улучшает выявление слабоконтрастных и низкоамплитудных деталей.
Применяется в клеточной биологии, вирусологии, протозоологии.
Освещение по Кёлеру (Köhler illumination)
Стандартный способ настройки освещения в микроскопии, обеспечивающий равномерность поля, оптимальное использование числовой апертуры и максимальное разрешение. Не является самостоятельным методом контраста, но обязательная база для всех остальных.
В полной мере реализуется на всей современной линейке: МИКМЕД-5
Флуоресцентно-спектральные методы
Используют набор фильтров (DAPI, FITC, TRITC, Cy5 и др.) и позволяют вести многоканальный анализ, совмещая несколько спектров в одном изображении. Основной метод молекулярной и клеточной биологии.
Методы отражённого света
Используются для исследования непрозрачных объектов: металлы, сплавы, керамика, микромеханика. Включают светлое поле, темное поле, ДИК, поляризацию в отражении, интерференцию, косое освещение.
Реализуются на металлографических микроскопах: МЕТАМ, БЛМ, ММН, МИМ.
Методы проходящего света
Используются для биологии, медицины, гистологии, микробиологии, растительных и животных тканей. Включают светлое поле, темное поле, фазовый контраст, DIC, поляризацию.
Реализуются на: линейке биологичекских и медицинских приборов.
Стереоскопические методы наблюдения
Используются для объёмного наблюдения крупных объектов: сборка, пайка, минералы, биология, криминалистика, ювелирные изделия.
Применяются на стереомикроскопах: МСП.