Оптика микроскопа

Основную функцию микроскопа обеспечивают оптические узлы и принадлежности. Они позволяют создавать увеличенное изображение объекта с достаточной степенью точности и достоверности. Объект можно чётко различить по форме, соотношению размеров, а также цвету и составляющих элементов. Помимо всего прочего оптика должна также обеспечивать максимально точное качество изображения, которое является основной целью исследований и отвечает требованиям методик проводимого анализа.

Основными составляющими микроскопа являются такие оптические элементы, которые образуют осветительную (конденсоры), наблюдательную (окуляры) и воспроизводящую (объективы) функции.

В современных лабораторных комплексах, таких как МИКМЕД-5 и МИКМЕД-6, все эти узлы работают согласованно: объектив формирует первичное изображение, тубусная оптика и окуляры/камера его преобразуют, а осветительная система задаёт корректный режим освещения (обычно по Кёлеру).

Основные оптические узлы микроскопа

В классическом прямом биологическом или медицинском микроскопе можно выделить два оптических тракта:

Изображающий тракт — объектив, тубусная линза (в бесконечно скорректированных системах), окуляр(ы), а также оптика фототубуса и адаптеров цифровой камеры.
Осветительный тракт — источник света, коллектор, полевую диафрагму, светофильтры, конденсор и апертурную диафрагму.

Именно согласованность этих трактов определяет качество изображения: разрешающую способность, контраст, равномерность освещения поля, отсутствие паразитных засветок и артефактов.

Объективы микроскопа

Объективы микроскопа представляют собой целую оптическую систему, целью которой является построение микроскопического изображения в плоскости изображения с соответствующим увеличением, разрешением элементов, точностью передачи и воспроизведения относительно формы и цвета объекта исследования.

Микроскопы, как правило, имеют довольно сложную систему оптической механики, которая может заключать в себе несколько отдельных одиночных линз и некоторых компонентов, которые склеены из двух или трёх линз. Количество линз зависит от поставленных объективу задач. Чем качественнее изображение, даваемое объективом, тем сложнее его система оптики. Общее количество линз в сложном механизме объектива может достигать четырнадцати.

Объектив состоит из передней (фронтальной) и последующей части. Фронтальная линза, или же система линз направлена на препарат и представляет собой основу при построении изображения соответствующего качества. Она также определяет рабочее расстояние и числовую апертуру объектива. Последующая часть вместе с фронтальной обеспечивает необходимое увеличение, качество изображения и фокусное расстояние. Она также отвечает за определение высоты объектива и длину тубуса микроскопа.

Основные параметры объектива

На оправе объектива обычно указываются его основные параметры в форме записи вида 40× / 0,65 ∞ / 0,17. Эта маркировка содержит:

Увеличение (например, 4×, 10×, 40×, 100×);
Числовую апертуру (NA) — величину, характеризующую способность объектива собирать свет и разрешать мелкие детали; чем выше NA, тем выше разрешение и тем меньше глубина резкости;
Тип оптической системы — «160» или «170» для конечной тубусной длины либо знак «∞» для бесконечно скорректированной системы;
Толщину покровного стекла (обычно 0,17 мм) либо указание 0 / - для объектива без покровного стекла;
Дополнительные обозначения: OIL (масляный иммерсионный), W (водный), Gly (глицериновый), PH (фазово-контрастный), DIC (дифференциально-интерференционный контраст) и т.п.

Рабочее расстояние (WD, working distance) — ещё один ключевой параметр. Это расстояние от фронтальной линзы объектива до плоскости объекта при наведении на резкость. Объективы с большим рабочим расстоянием упрощают манипуляции с препаратом, но при прочих равных имеют меньшую числовую апертуру.

Типы объективов по степени коррекции

В зависимости от уровня коррекции аберраций различают несколько основных классов объективов:

Ахроматические — базовый уровень; компенсируют хроматическую аберрацию для двух длин волн и сферическую аберрацию в центре поля; подходят для рутинной светлопольной микроскопии.
План-ахроматические — дополнительно выравнивают кривизну поля, обеспечивая резкость по всему полю зрения; используются во многих медицинских и биологических микроскопах, таких как МИКМЕД-5.
Флюоритовые (полуапохроматы) — обеспечивают более высокую коррекцию хроматизма и повышенную числовую апертуру; востребованы в флуоресцентной и исследовательской микроскопии.
Апохроматические и план-апохроматические — высококорректированные объективы для точных измерений, флуоресценции и многоканальных методов; выравнивают не только цвет, но и поле.

Для специальных методов применяются фазовые объективы (с фазовой пластинкой), DIC-объективы (с призмами Вольластона или аналогичными элементами), объективы для флуоресценции с повышенной пропускной способностью в УФ/синем диапазоне и т.д.

Бесконечно скорректированная оптика и тубусная линза

В современных микроскопах всё чаще используется схема с бесконечно скорректированными объективами. Такой объектив формирует параллельный пучок (изображение на «бесконечности»), который затем собирается тубусной линзой в промежуточное изображение.

Преимущества этой схемы:

возможность вводить в параллельный пучок дополнительные модули (фильтры, призмы, анализаторы, оптические компенсаторы) без существенного ухудшения изображения;
унификация тубусной оптики для разных серий объективов;
удобство создания модульных систем (например, микроскопы семейства МИКМЕД-6 с различными насадками и осветителями).

Иммерсионные объективы

Для достижения числовой апертуры выше ~1,0 применяют иммерсионные объективы, в которых пространство между покровным стеклом и фронтальной линзой заполняется иммерсионной средой с определённым показателем преломления.

Основные типы иммерсий:

Масляная иммерсия (oil immersion) — классический вариант, n ≈ 1,515;
Водная иммерсия — ближе по показателю преломления к живым объектам и водным средам;
Глицериновая и силиконовая иммерсия — используются в конфокальной и глубокой флуоресцентной микроскопии.

Важно использовать строго соответствующий тип иммерсионного масла, рекомендованный производителем объектива, и строго соблюдать требования к чистоте покровного стекла. Несоответствие показателя преломления или наличие загрязнений быстро приводит к падению разрешения и контраста.

Окуляры микроскопа

Окуляр — это оптическая система, предназначенная для наблюдения промежуточного изображения, сформированного объективом (и тубусной линзой в бесконечных системах). Он выполняет несколько функций:

дополнительное увеличение изображения (обычно 5×–20×);
формирование удобного для глаза выходного зрачка и поля зрения;
в некоторых типах — частичная компенсация остаточных аберраций объектива.

На оправе окуляра обычно указывается его увеличение и номер поля (field number, FN), характеризующий диаметр наблюдаемого поля в промежуточной плоскости. Например, FN 22 означает, что при соответствующем объективе можно получить широкое поле зрения, что важно для рутинных клинико-диагностических задач.

Существуют компенсирующие окуляры, которые специально рассчитаны для работы с определённой серией объективов и компенсируют их остаточные аберрации. В современных системах всё чаще применяют неккомпенсирующие окуляры, а основная коррекция переносится в объектив и тубусную оптику.

Для измерительных задач используются окуляры с сеткой или шкалой, которые в сочетании с калиброванным объект-микрометром позволяют выполнять микрометрические измерения.

Конденсор и осветительная система

Конденсор — оптический узел, формирующий на объекте пучок света нужной апертуры и однородности. Именно конденсор во многом определяет контраст и разрешение изображения при работе в проходящем свете.

Основные типы конденсоров:

Аббе-конденсор — простой и распространённый вариант для светлого поля; обеспечивает достаточное качество изображения для большинства рутинных задач;
Ахроматический и апланатический конденсор — с улучшенной коррекцией аберраций, используется для высоких увеличений и исследовательской работы;
Фазово-контрастный конденсор — с набором фазовых колец, согласованных с фазовыми объективами;
DIC-конденсор — с призматическими элементами для реализации дифференциально-интерференционного контраста.

В осветительную систему микроскопа, помимо конденсора, входят:

источник света (галогенный, светодиодный и др.);
коллектор или линзовая система, формирующая изображение источника света;
полевую диафрагму, задающую размер освещаемого поля;
апертурную диафрагму конденсора, задающую эффективную числовую апертуру освещения;
светофильтры и поляризационные элементы (при соответствующих методах).

Освещение по Кёлеру

Стандартом качественной светлопольной микроскопии является освещение по Кёлеру. Суть метода — раздельное изображение источника света и поля зрения в различных плоскостях оптической системы, что обеспечивает однородное освещение и оптимальное использование апертуры.

В общих чертах настройка включает следующие шаги:

Навести микроскоп на резкость на выбранном объекте при среднем увеличении.
Сильно прикрыть полевую диафрагму осветителя.
Перемещением конденсора по высоте сфокусировать изображение полевой диафрагмы в плоскости препарата.
Отцентрировать полевую диафрагму винтами центровки конденсора.
Открыть полевую диафрагму так, чтобы её изображение немного выходило за границы поля зрения.
Отрегулировать апертурную диафрагму конденсора на 60–80 % числовой апертуры объектива.

Корректно настроенное освещение по Кёлеру обеспечивает оптимальный баланс между контрастом и разрешением и является обязательным условием корректной работы биологических и медицинских микроскопов МИКМЕД-5 и МИКМЕД-6.

Дополнительные элементы оптического тракта

В состав оптики современного микроскопа также входят:

бинокулярные и тринокулярные насадки с призматическими системами и делителями потока (beam-splitter), позволяющими распределять свет между глазом и камерой;
фото- и видеотубусы с переходниками под C-mount камеры и специализированные цифровые камеры;
сменные насадки для поляризации, флуоресценции, фазового контраста, ДИК и других методов;
внутренняя оптика зум-насадок, тубусных увеличителей/редукторов, применяемых в цифровых комплексах и на микровизорах.

Требования к качеству оптики микроскопа

К оптике микроскопа предъявляются строгие требования по уровню аберраций. Основные из них:

сферическая аберрация — разная фокусировка центральных и краевых лучей;
хроматическая аберрация (осевая и поперечная) — различная фокусировка разных длин волн;
кривизна поля — невозможность одновременно получить резкое изображение в центре и по краю;
кома, астигматизм, дисторсия — искажения формы и размера изображения;
блики и призрачные изображения из-за множественных отражений.

Современные объективы и окуляры используют сложные комбинации линз и многослойные просветляющие покрытия, которые существенно уменьшают отражения и повышают контраст. Для достижения паспортных характеристик важно соблюдать все условия эксплуатации: использовать покровные стёкла нужной толщины, корректную иммерсионную среду, чистые линзы и правильно настроенное освещение.

Все эти требования реализованы в современных микроскопах серий МИКМЕД-5, МИКМЕД-6 и других медицинских и биологических микроскопах производства АО «ЛОМО» и ООО «Микроанализ».